Коровы из пробирки: прошлое и настоящее, ч. 1

               
      Опубликовано «Химия и жизнь – XXI век», 2008.- №10. Полная авторская версия

              МАДИСОН  Виктор Владимирович и Любовь Вениаминовна

                                   кандидаты биологических наук

                                      
         

                 Часть I. Мы помним, как все начиналось

«Иль нам с Европой спорить ново

Иль русский от побед отвык?»

А.С. Пушкин, 1831

       С середины 70-х годов прошлого столетия, после «лысенковского» застоя в Советском Союзе начали возрождаться биотехнологические исследования в эмбриологии млекопитающих. Благодаря первому и последнему президенту СССР М.С. Горбачеву биологическая наука и, особенно, биотехнологические разработки получили значительные материально-технические и финансовые вливания, как в научные учреждения Большой академии, так и в научно-исследовательской тематике Всесоюзной Академии сельскохозяйственных наук им. В.И.Ленина (ВАСХНИЛ).

            Существует следующая версия, как Горбачев вернул ТЭ (ТЭ) в СССР. Будучи в начале 80-х годов в США, он знакомился с сельским хозяйством и в гостях у фермера узнал, что эмбриология используется в практике воспроизводства племенного скота буднично - на равне с искусственным осеменением (ИО). Причем работу по ТЭ стимулирует законодательство страны за счет льготного налогооблажения фермеров-биотехнологов. Тогда как в СССР ТЭ сельскохозяйственных животных занимались лишь несколько ведущих НИИ животноводства. Непорядок, вероятно подумал Михаил Сергеевич, вызвал на ковер министра Агропрома В.К. Месяца и дело закрутилось. С тех пор и принято считать, что рождение отечественной ТЭ - дело не одного месяца.

  Председатель Госагропрома СССР, Валентин Карпович Месяц

 

Материально-техническое обеспечение и подготовку кадров для  использования трансплантации эмбрионов в племенном скотоводстве страны осуществляло Всесоюзное научно-производственное объединение по племенному делу в животноводстве (ВНПО, директор Жильцов Николай Захарович), которое блестяще справилось со своей задачей.

   

На фото слева: Николай Захарович Жильцов.  

Фото справа: Н. Жиьцов, С. Буссо (Франция, IMV), У реципиентов Анатолий Овчинников - один из первых мастеров отечественной ТЭ (ВИЖ) в  лаборатория ТЭ госплемзавода "Заря коммугнизма", 1985

      По-началу казалось, что зависимость советской трансплантации от зарубежных учителей, препаратов и инструментов будет определяющей на ближайшие десятки лет. ВНПО, при финансовой поддержке МСХ СССР, удалось за несколько лет осуществить революционный прорыв в этом вопросе. В п. Быково Московской области заработали постоянно действующие курсы по ТЭ, номенклатуру поступающих по импорту технологических составляющих более чем на половину удалось заменить разработками отечественных производителей.

      Наиболее ходовой в эмбриологии буферный раствор Дюльбекко производил ящурный институт (п. Юрьевец Владимирской области). Киевский завод резинотехнических изделий («Красный резинщик») освоил выпуск двухканальных катетеров Фоллея для извлечения эмбрионов из матки коров. ВНИИплем (Лесные Поляны, Московской обл) предложил фильтр для сбора эмбрионов, который по своим характеристикам (удобство в работе, практичность) превосходил зарубежные аналоги. Ленинградская оптика (МБС-9 и МБС-10) уступала зарубежным лупам лишь в цене. Оборонное предприятие в г. Подольске Московской области изготовило прекрасные катетеры для пересадки эмбрионов крупного рогатого скота.

      Для гормонального обеспечения суперовуляции коров-доноров был необходим настоящий прорыв, которым явилась замена дорогостоящего американского фолликулостимулирующего гормона (ФСГ-п) на отечественный фоллитропин и ФСГ-супер. Во Всесоюзном институте животноводства работала лаборатория по производству нативной сыворотки жеребой кобылы (СЖК) – сильнейшего стимулятора женской репродуктивной функции. Ветеринарные аптеки уже тогда были обеспечены советскими аналогами простагландина F-2µ (клатрапростин, эстуфалан).

      Приборы для замораживания эмбрионов в парах жидкого азота сконструировали специалисты Харьковского института криобиологии и криомедицины, а спиртовый замораживатель – в институте биофизики АН СССР (г. Пущино Московской области). Техника была проверена временем и оказалась на порядок дешевле зарубежных аналогов.

Ветераны советской трансплатации помнят незаменимого четырехколесного помощника эмбриологов, вездеход «зообиолаборатория» на базе УАЗ-452 (на фото).

      А ежегодные республиканские конкурсы мастерства и всесоюзные слеты - совещания трансплантатчиков на ВДНХ, главной выставке страны, были праздниками биотехнологической элиты страны.

      Они в СССР были первыми!  Ежегодные собрания  специалистов по трансплантации эмбрионов проходили на ВДНХ, фото 1985-86 гг. Узнай знакомых!

      На волне этого «эмбриологического» бума, более двадцати лет назад,  родилась первая в СССР производственная лаборатория ТЭ в подмосковном госплемзаводе «Заря коммунизма». Первые шаги ее становления освещал  журнал «Химия  и  жизнь» (Мадисон В.В., Мадисон Л.В.  Коровы-несушки // Химия  и  жизнь.— 1990.— №5).

      ТЭ продуктивных животных - относительно молодая биотехнология воспроизведения животных, ей всего чуть более полувека.  Ее зарождению предшествовали несколько веков отчаянных попыток ученых-биологов докопаться до истины зарождения жизни. Историю эмбриологии можно сравнить со слепым котенком, часто комичным, который в поисках материнского молока обследует все уголки необъятной комнаты (мироздания) и все-таки находит мать (истину).

      Муки зарождения эмбриологии, как науки, свидетельствуют о неиссякаемой пытливости и самоотверженности биологов всех времен и народов. К чести советской науки, наши эмбриологи были в числе первооткрывателей метода искусственно осеменения и ТЭ. Если бы еще отечественной эмбриологии не мешала политика… Что предшествовало появлению новой биотехнологии размножения сельскохозяйственных животных в СССР и - самое главное - с чем пришла отечественная ТЭ на рубеж второго тысячелетия?

 

Будь мужчиной! (Начало нашей эры)

      Первая книга о попытках стимулирования половой функции была написана в Древнем Риме философом Публиусом Овидиусом Насо (43 г. до н.э.-18 г. н.э.). В своем труде «Искусство любви» Овидий (так его обычно называют) за две тысячи лет до открытия психотропных средств и половых гормонов (без которых сегодня невозможно индуцировать полиовуляцию в яичниках) предостерегал от увлечения природными стимуляторами [1]: «Любовные напитки бесполезны, да и опасны; девчонки сходят с ума, получив такую добавку к вину; любовный напиток может повредить ум. Пусть нечестивые вещи будут под запретом. Если ты хочешь, чтобы она тебя любила, будь мужчиной, достойным любви. Здесь недостаточно лица и фигуры – добавь достоинства ума».

  За две тысячи лет (!) природа человека мало изменилась, проблемы – все те же. Как в мире соблазнов и легких путей оставаться мужчиной. Прожить «без дури» и легких соблазнов, стать достойным любви.

 

Главное – не перепутать (1500 лет назад)

       В рукописе (списке) «О земном устроении» - памятнике русской культуры начала VI века находим первые наивные догадки о зарождении жизни и прогнозировании пола потомства [2]: «И если семя у обоих  сильное - мужского пола бывает ребенок; если же послабее -  бывает женского пола… И если с правой стороны впадет, ребенок  мужского пола будет, а если с левой – женского пола».

 

Королю - оленя, ученым – матку (350 лет назад)

      В 1651 году Вильям Харви, чтобы выяснить откуда появляется плод, подверг антомированию благородного оленя, убитого королем Карлом I. Ученый ожидал обнаружить в матке оленя после спаривания смесь семени и менструальной крови, которые, по его мнению, образуют эмбрион, позже вырастающий до величины птичьего яйца. Не найдя в матке следов ни мужского, ни женского начала, исследователь посчитал, что эмбрион образуется непосредственно в матке под влиянием «испарения» семени. Мнение В. Харви поддержали и другие ученые, в том числе имеющие высокое положение в обществе, но допустившие в своих экспериментах методические ошибки [3].

  В. Харви       P. де Грааф

      Месторасположение фолликула в яичнике (граафов пузырек) было впервые описано Ренье де Граафом в 1673 году, а спустя 4 года Датчем и Левенгук впервые разглядели и с изумлением рассматривали под микроскопом движущиеся сперматозоиды [2].

 

Первое искуственное осеменение (250 лет назад)

      Первым (за исключением древних арабов), кто осуществил и трогательно описал процесс искусственного осеменение, был итальянец Лаццаро Спалланцани. В 1784 году он опубликовал результаты своего опыта на суке спаниеля [3]: «…Через 62 дня после введения семени сука родила троих живых щенят, которые по окраске и форме были похоже не только на суку, но и на пса, от которого было взято семя. Таким образом я достиг оплодотворения этих четвероногих, и я могу искренне сказать, что я никогда не получал большего  удовольствия от какого-нибудь дела».

 

Увидеть яйцеклетку и обомлеть (180 лет назад)

      До начала XIX века все еще не был известен механизм появления зародыша в матке. Даже в 1824 году Геттингенская Академия наук присваивает приз за открытие места образования яйцеклеток млекопитающих работе, которая доказывала, что в этом процессе ведущая роль принадлежит матке. И лишь 3 года спустя открытие эстонца Эрнста фон Бэра положило конец этой путанице. Исследователь обнаружил у собаки настоящее место появления яйцеклеток – яичник.

      Вот как описывал свое эмоциональное состояние ученый, впервые обнаруживший под микроскопом яйцеклетки в «неположенном» для них месте [3]: «Я заметил маленькое пятнышко в одном из фолликулов Граафа, а затем во многих других, но всегда только одно пятнышко. Странно – подумал я. Что бы это могло быть? Я вскрыл фолликул и перенес пятнышко с помощью ножа на покрытое водой стекло, которое я положил под микроскоп. Когда я рассмотрел его, я отпрянул назад, как будто меня ударила молния, так как я увидел очень маленькую, четко очерченную, желтоватую сферу. Я должен был придти в себя, перед тем, как я отважился взглянуть опять, потому что я боялся, что меня посетил призрак».

      Как известно, наука была привнесена в Россию, по настоянию Петра I. Академия Наук в Петербурге стала оплотом просвещения и привлекала в Россию лучших ученых с Запада. В 1834 году в Россию переехал для работы тот самый Карл Бэр (1792-1876), один из основателей эмбриологии. Он первый открыл яйцеклетку и детально описал ход индивидуального развития у животных.

     Карл Максимович Бэр

      Вскоре появились описания трубных яйцеклеток овцы (1840), собаки (1845), свиньи (1897), коровы (1931), кобылы (1939) и человека (1928). А первые наблюдения за оплодотворением и расщеплением зиготы были выполнены на амфибиях Ньюпортом в 1853 году.

 

Появление «святого» Хипа (120 лет назад)

      В апреле 2010 года будет 120 лет изящному опыту исследователя из Кэмбриджа (Великобритания) Вальтеру Хипу (Walter Heap, 1855-1929 гг.), осуществившему первую в мире успешную пересадку эмбрионов на кроликах. Признанный авторитет в области практической трансплантации канадец К. Дж. Беттеридж так оценил заслуги британского биолога [3]: «Если бы Международная организация по трансплантации эмбрионов имела своего “святого  покровителя”, то им бы стал Вальтер Хип».

      С «легкой руки» профессора Хипа было положено начало фундаментальным исследованиям в эмбриологии и искусственном осеменении (1897-1898), сделано научное обоснование возможности выведения высокопродуктивных специализированных пород с экономическим обоснованием этой еще не родившейся отрасли зоотехнической науки – селекции продуктивных животных (1899, 1906). За 18 лет до получения доказательств участия в течке млекопитающих яичников (открытия эстрогенов будет в 1923 г.), исследователь предположил, что охота самок зависит от взаимодействия между «воспроизводительным ферментом» и «гонадом», которые выделяются репродуктивными железами. Наивность этих намеков на эндокринную функцию яичников может вызвать улыбку современного биолога, но вполне объяснима, если учесть зачаточное состояние эндокринологии (науки о гормонах) в конце XIX века.

      Достаток преподавателя высшей школы в начале прошлого столетия, располагал к творчеству и фантазиям. О разностороннем увлечении британских ученых той поры можно судить по изобретенной им на досуге «синематографической скоростной машине» Хипа и Гриаллса, а о характере великого мастера – по его любимому хобби, охоте на слонов. Многие ли отечественные профессора и академики могут позволить себе охоту на слонов?

      Биограф В. Хипа вспоминает, что профессор отвечал за университетское лабораторное руководство по обнаружению и визуальной демонстрации студентам эмбрионов кролика, успешно совмещал учебную и научную деятельность. Техническим оснащением первой лаборатории по ТЭ были пикообразные иглы для сбора эмбрионов, часовые стекла с вогнутым дном, стеклянные капиллярные трубки, 0.75% солевой раствор поваренной соли для промывания сегментов яйцевода, оптические приспособления в виде лупы. Все это нехитрое оборудование мало изменилось за прошедшее столетие и вполне пригодно сегодня для обучения начинающих эмбриологов.

      Итак, 27 апреля 1890 г. профессор Кембриджского университета поставил эксперимент по изучению явления «телегонии» (переливанию) наследственных признаков от родителей к потомству. Была поставлена задача - изучить изменение наследственных признаков зародыша под влиянием чужой матки реципиента. С этой целью Хип нашел и перенес два 4-клеточных эмбриона (32-часового возраста) от чистопородной ангорской крольчихи в матку самке породы бельгийский чемпион, предварительно спаренной с самцом той же породы. Спустя месяц крольчиха–реципиент родила первых в мире трансплантатов – двух длинношерстных ангорских крольчат, вместе с четырьмя родными бельгийскими. Успех этой трансплантации и неудачи предыдущих попыток были в значительной степени предопределены тем, что исследователь впервые выполнил условия синхронности пересадки для возраста эмбриона и стадии «зрелости» матки реципиента. Это правило в пределах ±12 часов остается актуальным и для современных трансплантаций зародышей.

      Ко времени осуществления описанного опыта в Британии уже на протяжении 140 лет шла работа по эмпирическому и визуальному улучшению продуктивных качеств домашнего скота. Сам профессор, основатель нового направления – биотехнологии воспроизведения - остался равнодушным к своему детищу. Он не связывал свой успех с возможностью использовать технику ТЭ в селекции сельскохозяйственных животных, считал блестяще проведенный опыт рядовым учебным экспериментом, результаты которого опубликовал в очередном номере журнала «Nature».

      И только к середине следующего столетия, с открытием гонадотропинов (гормонов половой функции, Х. Коул и Г. Харт, 1930), новая биотехнология размножения пережила второе рождение, воздав должное профессору из Кэмбриджа и его альма-матер, ставшей меккой для многих ученых-эмбриологов, последователей великого мастера.

 

Биотехнологи поглядывают на фермы (100 лет назад)

      В 1902 г. в научный обиход был введен термин гормоны, а зоолог из Филадельфии Мак Кланг описал полоопределяющие хромосомы Х и Y [2]. Были установлены тесные взаимосвязи между передним гипофизом и яичниками, получила развитие техника искусственного осеменения (ИО) и лабораторного культивирования яйцеклеток.

      В 1929 году Г. Пинкус из Гавардского университета с использованием гормонов передней доли гипофиза (сегодня самые ходовые гонадотропины биотехнологов) получил и прокультивировал более 50 оплодотворенных яйцеклеток кролика за один половой цикл. Комментируя эту пионерскую работу последователя В. Хипа, кэмбриджские исследователи Ф. Маршалл и Дж. Хэммонд в 1946 году писали: «Эти эксперименты необходимо распространить на животных ферм, на которых ИО уже имеет большие возможности» [3].

      Использование сыворотки жеребой кобылы (СЖК) сначала было предназначено для терапии гипофункции яичников и внесезонного разведения овец. СЖК-суперовуляция коров для «доения» яйцеклеток впервые испытана Д. Доулингом в 1949г. И лишь спустя двадцать лет при использовании гипофизарного фолликулостимулирующего гормона  (ФСГ) О. Эвери (1962) удалось получить от коров от 4 до 55 одновременных овуляций яйцеклеток  [5]. Призрак производственной ТЭ бродил по Европе.

 

Наша свинья в истории ТЭ (55 лет назад)

      В 40-х годах в Сан-Антонио (США, штат Техас) Г. Пинкус и Чат начали отрабатывать приемы пересадки эмбрионов у крупного рогатого скота. За 8 лет исследований было использовано 750 коров.

      Между Кэмбриджем и Сан-Антонио установилось тесное научное сотрудничество. Ученик Хэммонда доктор Чат прибывает в США для разработки суперовуляционной модели стимуляции яичников коров-доноров. За несколько лет работы сферой его интересов также становится хранение эмбрионов при 10°С в течение нескольких дней (1947-1948), демонстрация эмбриотоксических факторов в неинактивированной сыворотке овец и крупного рогатого скота (1944), определение пределов асинхронности половых циклов донора и реципиентов (1952) и рождение первых мышей после оплодотворения яйцеклеток in vitro (1959). Вот что значит объединение ученых «без границ» для решения конкретной задачи!

      В апреле 1949 года фонд прикладных исследований в Сан-Антонио субсидировал проведение первой конференции, посвященной ТЭ и ее практическому использованию. К этому времени Р. Умбау получил 4 стельности коров от пересадки эмбрионов, которые закончились абортами на 8 месяце стельности. Поэтому первым живым теленком-эмбриотрансплантатом считается приплод, полученный в университете штата Висконсин в 1951 году. Пятидневные эмбрионы были извлечены после убоя донора и помещены в контрлатеральные (противоположные) желтому телу яичника рога матки, чтобы полностью исключить возможность рождения собственного теленка реципиентами (хотя они и не осеменялись). Один из трех полученных таким образом телят появился на свет после длительного культивирования в лабораторных условиях, что дало повод уже тогда судить о значительной выносливости in vitro эмбрионов коров [3].

      Наш полтавский биотехнолог профессор А.В Квасницкий привнес свою «свинью» в список мировых достижений, опередив на год появление американских телят-трансплантатов.

   У памятной доски А.В. Квасницкого.  Слева - Н.А. Мартыненко, жена и соратница первооткрывателя, Полтава, НИИсвиноводства - 2000

 

Первые успешные пересадки эмбрионов млекопитающих (год - вид - исполнитель):

1890 - кролик - Heape

1933 - крыса - Nicholas

1934 - овца - Warwick et al.

1942 - мышь - Fekete & Little

1949 - коза - Warwick & Berry

1950 - свинья - Kvasnickii

1951 - корова - Willet et al.

1964 - корова (нехирургшически) - Mutter  et. al.

1968 - хорек - Chang

1974 - лошадь - Oguri & Tsutsumi

1976 - бубуин - Kraemer et al.

1978 - человек - Steptoe & Echwards

1978 - кошка -Sehriver & Kraemer

1979 - собака - Kinney et al.

        От открывшихся возможностей манипулирования зарождением жизнью – захватывало дух. Последующие полстолетия отмечены настоящим «валом» исследований и разработок в области эмбриологии, которые сегодня вылились в серьезные работы по генетической инженерии и клонированию млекопитающих, а также явно авантюристические проекты, получившие у продвинутой молодежи термины «нано- био-пурга» - способы выкачивания денег у доверчивых спонсоров и государственных бюджетов. 

      Эру клонирования открыли работы Бригса и Кинга (1952), которые впервые показали, что можно заменить ядро зиготы (оплодотворенной яйцеклетки) ядром соматической клетки у лягушки и получить взрослое животное. Первая трансгенная мышь появилась  (1980) благодаря усилиям Гордона и др.

      В 1997 году из соматической клетки овцы былат получена взрослая клонированная овца Долли. Которая, кстати, сдохла при загадочных обстоятельствах. Это был первый серьезный «звоночек», что в механическом клонировании не все так просто. Подводные камни бесцеремонного вмешательства в управление  святого-святых – зарождение жизни – еще впереди.  

       Первая американская женщина была использована как суррогатная мать-реципиент оплодотворенных яйцеклеток чужих супругов в 1986году. Спустя семь лет уже бабушка смогла «родить» себе внука - 53-летняя американка выносила ребенка после пересадки эмбриона от невестки [4]. То ли еще будет, ой ей ей…

 

Back to top